はじめに
本検査はリンパ腫やリンパ性白血病の診断のための補助ツールとして、リンパ球がモノクローナル（腫瘍性）に増殖しているのかポリクローナルに増殖しているのかを評価することで、腫瘍性増殖か否かを判断し、形態評価など他の検査との組み合わせにより一段と精度の高い診断を可能とするものです。
原理
DNAの遺伝情報は細胞の種類により違いはなく、基本的には同じです。しかし、T・Bリンパ球は例外で、一部の遺伝子がリンパ球により異なります（図1）。Tリンパ球に発現しているT細胞レセプター（TCR：T-cell receptor）遺伝子は、各Tリンパ球により配列の順序や長さが異なります（多様性が存在）。また、Bリンパ球では免疫グロブリン（Ig：Immunoglobulin）遺伝子が各Bリンパ球により異なります。この多様性はリンパ球の分化過程で遺伝子再構成（遺伝子の組み換え）により獲得され、多数の抗原を認識するための多様性メカニズムの一つであり、他の細胞には存在しません。
図１．T細胞レセプター（TCR）遺伝子と免疫グロブリン（Ig）遺伝子の比較
Tリンパ球では複数のDNA断片から数個の断片が選抜されT細胞レセプター遺伝子が構成されています（遺伝子再構成）。遺伝子再構成により作られたT細胞レセプター遺伝子は各Tリンパ球により大きさや配列順序が異なります（多様性が存在）。Tリンパ球がもつ免疫グロブリン遺伝子には遺伝子再構成は起こりません。一方、Bリンパ球ではT細胞レセプター遺伝子には遺伝子再構成は起こりませんが、免疫グロブリン遺伝子に起こります。免疫グロブリン遺伝子は各Bリンパ球により異なります。T・Bリンパ球以外の細胞では、２つの遺伝子に遺伝子再構成は起こりません。
リンパ腫との鑑別が困難な場合がある反応性過形成では、組織の中で種々のリンパ球が増殖しており（図2A上段）、この増殖をポリクローナルな増殖といいます。一方、リンパ腫（リンパ性白血病）では腫瘍化したリンパ球が他のリンパ球よりも相対的に多く、単一の細胞集団を形成しており（図2A下段）、この増殖をモノクローナルな増殖といいます。リンパ球集団が持つTCRまたはIg遺伝子を比較すると、ポリクローナルに増殖しているリンパ球集団では遺伝子に多様性が存在するのに対し、モノクローナルに増殖しているリンパ球集団では遺伝子は単一です（図2B）。クローナリティー解析では、TCR/Ig遺伝子の多様性の有無を調べることでT/Bリンパ球のモノクローナルな増殖の有無を検出します。
図２．クローナリティー解析の流れ
反応性過形成や正常なリンパ節ではリンパ球がポリクローナルに増殖し、リンパ腫やリンパ性白血病ではモノクローナルに増殖しています（A）。ポリクローナルなリンパ球集団ではIg/TCR遺伝子に多様性が存在しますが、モノクローナルなリンパ球集団では同一です（B）。これらの遺伝子をPCRにより増幅し（C）、電気泳動により増幅された遺伝子を大きさに従い分離します（D）。ポリクローナルに増殖している反応性過形成・正常な組織では増幅された遺伝子が支持体全体に広がるためスメア状に検出されます。モノクローナルに増殖しているリンパ腫・リンパ性白血病では、増幅された遺伝子の長さが同じであるため支持体内の同じ位置に移動し、単一の遺伝子の増幅が検出されます。
検体由来のTCR/Ig遺伝子をPCR（Polymerase chain reaction）法により増幅し（図2C）、電気泳動にかけ（図2D）、遺伝子の多様性の有無を判別します。電気泳動では短い遺伝子はスタート地点からの移動距離が長くなりますが、長い遺伝子は支持体の網目にひっかかり移動距離が短くなります。ポリクローナルな増殖では様々な長さの遺伝子が移動するため、泳動後にスメア状に観察されますが、モノクローナルな増殖では増幅された遺伝子の長さが同じであるため、支持体内での移動距離が全て同じになり、明瞭な単一バンドとして検出されます（複数本検出されることもあります）。TCR遺伝子の単一な増幅が検出された場合、Tリンパ球がモノクローナルに増殖していると判定され（図3A）、Ig遺伝子に単一な増幅が検出された場合にはBリンパ球がモノクローナルに増殖していると判定されます（図3B）。
図3．クローナリティー解析の結果
A では患者（レーン1）のTCR に単一のバンドが検出されていますが、Ig には検出されていません。この結果よりT リンパ球のモノクローナルな増殖と判定されます。B ではTCR には検出されずIg に単一バンドが検出されていることから、B リンパ球のモノクローナルな増殖と判定されます。1：患者、2：陰性対照、3：陽性対照
検査の精度
クローナリティ解析の感度と特異度
表1 に犬と猫において細胞診・病理診断により診断のついた症例での解析結果を示しました。犬におけるリンパ腫症例では、単一バンドが検出（モノクローナルな増殖が検出）された割合はIg（B リンパ球のモノクローナルな増殖）が66.5% (161/242)、TCR（T リンパ球のモノクローナルな増殖）が24.8%（60/242）、そしてIg とTCR の両方が2.9%（7/242）でした（表1 上段）。一方、猫においてはIg が39.1％（45/115）、TCR が32.1％（37/115）、そしてIg とTCR の両方が4.3％（5/115）でした（表１下段）。両方に単一バンドが検出された場合、T/B 分類は困難ですがリンパ球がモノクローナルに増殖していると判定されます。このため、リンパ球がモノクローナルに増殖していると判定された割合の合計は犬では94.2%（228/242）、また猫では75.7％でした。また、犬のデータですが正常なリンパ節、上皮性腫瘍のリンパ節転移、肥満細胞腫、組織球性肉腫などリンパ腫以外の疾患と診断された症例では、モノクローナルな増殖が検出された割合は5.9%（2/34）であり、検出されなかった割合94.1%（32/34）でした（表1 中段下）。これらの結果から感度は94.2%、特異度は94.1% と算出されます。
参考として反応性過形成と診断された症例での検出率も算出したところ（表1 中段上）、26.0%（25/96）の検体でリンパ球のモノクローナルな増殖が検出されました。このように細胞診・病理診断の結果とクローナリティー解析の結果が異なる場合には、一般的にはリンパ腫の診断の基本となる形態学的評価を優先します。しかし、形態学的評価では初期のリンパ腫を見逃す可能性があり、特に細胞診では成熟リンパ球が腫瘍化した高分化型リンパ腫の診断は困難です。したがって、このような場合にはリンパ腫を否定せず慎重に臨床経過を観察する必要があります。
表1．クローナリティー解析の感度と特異度
*1 細胞診・病理診断によりリンパ腫と確定診断のついた症例
*2 細胞診・病理診断により反応性過形成と診断された症例
*3 上皮性腫瘍のリンパ節転移、肥満細胞腫、組織球性肉腫、白脾髄過形成など
Ig: Ig 遺伝子に単一バンドを検出（B リンパ球のモノクローナルな増殖）
TCR: TCR 遺伝子に単一バンドを検出（T リンパ球のモノクローナルな増殖）
Ig・TCR： Ig 遺伝子とTCR 遺伝子の両方に単一バンドを検出
検出されず：単一バンドが検出されない検体
細胞診もしくは病理診断によりリンパ腫、反応性過形成、他の疾患と確定診断された症例において、クローナリティー解析の検出率を算出しました。検体は細胞診・病理診断を行った部位と同一です。
クローナリティー解析におけるT/B 分類の精度
表2 ではクローナリティー解析のT/B 分類の精度について検討しました。リンパ球表面マーカー解析により、明らかにB もしくはT リンパ球の腫瘍性増殖と判定された検体を用い、クローナリティー解析の検出率を算出したところ、リンパ球表面マーカー解析によりB リンパ球の腫瘍性増殖と判定された検体では、クローナリティー解析によりIg に単一バンドが検出された割合は94.3％（33/35）でした。一方、リンパ球表面マーカー解析によりT リンパ球の腫瘍性増殖と判定された検体では、TCR に単一バンドが検出された割合は87.5%（7/8）でした。T・B リンパ球ともリンパ球表面マーカー解析の結果とクローナリティー解析の結果が高い確率で一致することから、クローナリティー解析は腫瘍性増殖の検出だけでなく、症例によりクローナリティー解析しか利用できない場合は、T/B 分類にも有用性の高い検査であると考えられます。
表2．クローナリティー解析におけるT/B 分類の精度
Ig: Ig 遺伝子に単一バンドを検出（B リンパ球のモノクローナルな増殖）
TCR: TCR 遺伝子に単一バンドを検出（T リンパ球のモノクローナルな増殖）
Ig・TCR： Ig 遺伝子とTCR 遺伝子の両方に単一バンドを検出
検出されず：単一バンドが検出されない検体
リンパ球表面マーカー解析によりB もしくはT リンパ球の腫瘍性増殖と判定された検体において、クローナリティー解析の検出率を算出しました。
検体
クローナリティ解析は、「少量の細胞で検査が可能」「死滅、破壊された細胞でも検査が可能」な利点があります。最も重要な点は、検査に用いる検体中に腫瘍化が疑われるリンパ球が存在していることで、例えばリンパ腫であってもステージV に至っていない段階で血液を用いて検査した場合には「検出されない」と判定されます。検体中に腫瘍性に増殖していると考えられるリンパ球が含まれていることを確認した上で検査に出すことが勧められます。また、ホルマリンに浸漬された組織はDNAの断片化により検査感度が低下する場合があるため、検査に用いるのは避けてください。
注意点
クローナリティー解析はリンパ腫、リンパ性白血病診断への補助ツールとして有用です。しかし、本解析のみで診断することは誤診につながる可能性がある点に注意する必要があります。重度のアカラス症の症例のリンパ節からT リンパ球のモノクローナルな増殖を検出した経験があります。これは特定の抗原に強く反応したリンパ球が他のリンパ球よりも増加し、腫瘍性増殖と同じ様にモノクローナルに増殖した結果と考えられています。さらに、表１にも示したようにリンパ腫、リンパ性白血病であっても異常を検出できない症例が少なからず存在するため、細胞診、病理診断と併せて利用する必要があります。
よくあるご質問
モノクローナルな増殖が検出された場合、腫瘍性と断定してもよいですか？
断定はできませんが、腫瘍の可能性は高いと考えられます。稀にリンパ球が反応性に増殖しているにもかかわらず、異常が検出される場合があります（重度な感染症など）。これは抗原に対し特定のリンパ球が増殖していると予想されます。確定診断にはクローナリティー解析だけでなく、細胞・組織の形態学的評価とあわせ診断することをお勧めします。
リンパ系腫瘍以外でモノクローナルな増殖が検出されたことはありますか？
ニキビダニの重度感染の症例でリンパ節からT リンパ球、猫伝染性腹膜炎の症例で腹水からB リンパ球のモノクローナルな増殖が検出されたことがあります。病原体に反応した特定のリンパ球がモノクローナルに増殖したと考えられます。しかし、これらの症例は例外中の例外です。
細胞診（病理診断）では反応性過形成と判定されましたが、クローナリティー解析で異常が検出されました。
どちらの結果を信頼すれば良いですか？
細胞診（病理）を優先すべきとされています。しかし、クローナリティー解析は初期病変など腫瘍化したリンパ球が少ない場合にも異常を検出できる特徴があります。したがって、リンパ系腫瘍を否定せず、注意深く経過を観察する必要があります。
T/B 分類する意義は何ですか？
予後と化学療法に対する反応を予測することができます。イヌのB 細胞性リンパ腫はT 細胞性リンパ腫に比較して、予後が良く抗癌剤への反
応も良いという研究結果が発表されています。
異常が検出されなければ、リンパ球の腫瘍は否定できますか？
完全には否定できません。リンパ腫と診断された症例のなかには、クローナリティー解析で異常が認められない症例が存在します。これらの症例には、いわゆるNon-T/Non-B タイプ（NK 細胞など）のリンパ腫や現在の技術では検出することのできない稀なT/B 細胞性リンパ腫が含まれます。特にB リンパ球では体細胞突然変異が起こるため、モノクローナルな増殖が検出されない場合があります。
スライド標本や病理診断の切片から検査できますか？
細胞診用のスライド標本から検査できます（固定、染色、封入、いずれの段階からも可能）。ただし、塗抹した細胞の数が極端に少ないと十分なDNA が採れない場合があります。可能ならば、複数枚ご用意ください。病理診断のパラフィン切片で検査を行うことはお勧めできません。
DNA はホルマリン固定により切断されるため、検査の感度が低下します。場合によっては、モノクローナルな増殖であるのか否かを判別できない場合があります。病理診断を優先して行う場合には、採取した組織の一部をホルマリン固定せず、凍結保存して下さい。半永久的にクローナリティー解析が可能となります。
検体を採取しましたが、クローナリティー解析をするか迷っています。どれくらいの期間保存できますか？
解析するDNA は比較的安定な物質です。長期の保存にも耐えられます。ただし、検体中で雑菌が増殖すると犬・猫のDNA に雑菌のDNAが混入し、偽陰性・偽陽性の原因となります。３～５日は冷蔵保存、それ以上の場合には冷凍保存して下さい。
悪性度の評価はできますか？
腫瘍性増殖の有無を判定することができますが、悪性度の評価はできません。
リンパ腫とリンパ性白血病の鑑別はできますか？
困難です。血液で腫瘍性に増殖しているリンパ球が骨髄由来（リンパ性白血病）であるのか、それともリンパ節由来（リンパ腫）であるのか、判別はできません。
腫瘍マーカーとして使えますか？
使えません。検体中に腫瘍性に増殖しているリンパ球が存在しない場合（例：リンパ腫であるが血液中には腫瘍細胞が出現していない場合）には、異常の検出は出来ません。
縦隔型リンパ腫と胸腺腫の鑑別はできますか？
明確に分けることは困難ですが、2018 年に13 症例の犬の胸腺腫において12 例でポリクローナルな増殖（92.3％）、1 例でT 細胞のモノクローナルな増殖が認められたと報告がされました。胸腺腫でモノクローナルな増殖を示す可能性は低いと考えられます。
プラズマ細胞腫でモノクローナルな増殖を示しますか？
リンパ腫に比べてモノクローナルな増殖を示す率は低いです。遺伝子再構成後に起こる体細胞突然変異によりプライマー配列との親和性が低下することが原因と考えられます。2018 年の報告では、犬の皮膚プラズマ細胞腫およびDLBCL におけるモノクローナルな増殖の検出率が報告され、それぞれ41.4％および91.3％と示されています。