学術発表
 

学会・講演会や論文で公表された当社関連の学術的な発表を公開します。
(原文は、著作権を管理する団体や発表者の了解を得て掲載しております。)




論文発表
2008年
当社が作製した抗イヌCD56抗体に関する論文が公表されました。
タイトル: Generation of monoclonal antibody against canine neural-cell adhesion molecule.
著者: Uematsu Y, Yamaguchi T, Koike A, Yagihara H, Hasegawa D, Matsuki N, Ono K, Washizu T, Arai T, Bonkobara M.?

概 要: (詳細はPDFファイル参照)
A monoclonal antibody, K9BYU, was generated using Escherichia coli recombinant extracellular domain of canine neural-cell adhesion molecule (N-CAM) as an antigen. Immunoreactivity of K9BYU to insect cell recombinant canine N-CAM was demonstrated by Western blotting using Sf9 insect cells transfected with the canine N-CAM gene. In Western blotting against canine brain tissue, K9BYU detected three isoforms of N-CAM that correspond to three major isoforms of human and mouse N-CAM (N-CAM-120, -140, and -180). From these results, K9BYU was considered to be a useful tool for research of canine N-CAM.。

イヌのneural-cell adhesion molecule (N-CAM) 細胞外領域の大腸菌組み換え蛋白を抗原としてモノクローナル抗体 (K9BYU) を作製した。イヌのN-CAM遺伝子を導入したSf9昆虫細胞を用いてウエスタンブロッティングを行ったところ、K9BYUは昆虫細胞組み換えイヌN-CAMを認識することが示された。K9BYUを用いたイヌ脳組織のウエスタンブロッティングでは、ヒトおよびマウスにおけるN-CAMの主要な3種類のアイソフォーム(N-CAM-120、-140および -180)に相当するイヌN-CAMのアイソフォームが検出された。これらの結果から、K9BYUはイヌのN-CAMを研究する上で有用な抗体であると考えられた。



学術発表
2009年
第148回日本獣医学会学術集会(9月25〜27日、鳥取大学 他)
演題名: HS-36「リンパ腫が疑われたイヌ84症例におけるリンパ球表面マーカー解析の有用性」
演 者: 岩崎圭子 (株式会社ケーナインラボ)他6名
概 要: 講演要旨PDF1、スライドPDF2参照
スライドPDF.1  スライドPDF.2 対応
[背景]近年、リンパ球系腫瘍の解析方法としてPCR法を用いたクローナリティー解析が一般的に利用できるようになった。しかし、本解析により検出できない稀な症例が存在することが問題となっている。そこで本演題ではリンパ腫の疑われた84症例について、クローナリティー解析と同時に腫瘍化したリンパ球の系譜を明らかにすることが可能なフローサイトメトリー(FCM)法によるリンパ球表面マーカー解析を行い、その有用性を検討した。


日本獣医内科学アカデミー/日本獣医臨床病理学会2009年大会(2月13〜15日、東京都、京王プラザホテル)
演題名: 1-A-7-19「活性化自己リンパ球療法を行った悪性中皮腫の犬の1症例
演 者: 星 清貴 (帯広畜産大学臨床獣医)他4名
概 要: (講演要旨PDF1参照)
スライドPDF.1  対応
はじめに:悪性中皮腫は、胸腔、腹腔あるいは心嚢における漿膜中皮細胞の腫瘍であり、腫瘍の浸潤に伴う毛細血管の破壊およびリンパの流れの阻害などによって、体液の貯留を随伴することが多い。また、本腫瘍の治療は一般的に抗癌剤の静脈内や体腔内投与が報告されているが、反応が認められないことも多い。今回我々は、顕著な胸水、腹水の貯留を伴う悪性中皮腫の犬に対して活性化自己リンパ球療法と化学療法を実施し、良好な結果を得られたのでその概要を報告する。


日本獣医内科学アカデミー/日本獣医臨床病理学会2009年大会(2月13〜15日、東京都、京王プラザホテル)
演題名: 「JSVCPシンポジウム、最新の臨床検査〜ここまでできる外注検査」
腫瘍の検査:分子表的療法を目的とした肥満細胞腫のc-kit遺伝子変異検 査
演 者: 盆子原 誠  (日本獣医生命科学大学・獣医臨床病理学教 室)
概 要: (講演要旨PDF1参照)
スライドPDF.1  対応
 [はじめに] 犬において、肥満細胞腫は分子標的薬イマチニブ(商品名グリベック・ノバルティス)の効果が報告されている唯一の腫瘍である1,2)。しかしながら、イマチニブは全ての肥満細胞腫に対して効果を示すわけではない。イマチニブは特定の症例においてのみ効果を示し、特にc-kit 遺伝子に変異を有する肥満細胞腫で効果が期待される。本発表 では、犬の肥満細胞腫においてイマチニブを用いる際のc-kit 遺伝子変異検査の有用性について解説する。


日本獣医内科学アカデミー/日本獣医臨床病理学会2009年大会(2月13〜15日、東京都、京王プラザホテル)
演題名: 「JSVCPシンポジウム、最新の臨床検査〜ここまでできる外注検査」
 リンパ系腫瘍におけるフローサイトメトリー法の有用性
演 者: 植松洋介  (株式会社ケーナインラボ)
概 要: (講演要旨PDF1、スライドPDF(1)(2)(3)を参照)
スライドPDF.1   
スライドPDF.2(1)   スライドPDF.2(2)  スライドPDF.2(3)  対応
 [はじめに] フローサイトメトリー(FCM)法は1970年代に確立された解析手法であり、細胞系譜の同定や細胞集団における特定の細胞系譜の割合を示す事が可能である。このため、FCM法はイヌのリンパ系腫瘍の検査方法として以前から広く用いられてきた。リンパ系腫瘍におけるFCM法の利点は、1)単一のリンパ球集団の異常な増加を検出できること、2)リンパ系腫瘍のTまたはBリンパ球(T/B)分類ができることである。通常、末梢血やリンパ節は複数のリンパ球集団から構成されるため、FCM法で単一のリンパ球集団の異常な増加が検出された場合は腫瘍性増殖が疑われる。また、リンパ系腫瘍においてT/Bの細胞系譜が分かる事で予後の違いを考慮する事ができる。しかしながら、すべてのリンパ系瘍 においてFCM法が有用なわけではなく、解析に適さない場合や結果の解釈注意するべき場合もある。本発表ではFCM法の原理から解析結果の解釈方法さらにFCM法における注意点について解説する。


2008年
第10回日本獣医臨床獣医学フォーラム記念大会2008でプログラム協賛しました。
演題名: 徹底攻略肥満細胞腫−分子標的治療
Molecular targeted-therapy for mast cell tumor
演 者: 盆子原 誠 (日本獣医生命科学大学 獣医臨床病理学教室 講師)
概 要: (詳細はPDFファイル参照)
要約:KITはc-kit 遺伝子にコードされるl型のチロシンキナーゼ受容体で、幹細胞因子の結合により、チロシンのリン酸化を介して細胞の分化・増殖を誘導する。犬の肥満細胞腫ではc-kit遺伝子の細胞膜近傍領域に重複配列の挿入変異が見られる場合がある。また、このようなc-kit遺伝子の変異はKITの異常なリン酸化を引き起こし、肥満細胞腫の発生・増悪に深く関わっていることが知られている。このため,変異KITを標的とした分子標的薬グリベック?が犬の肥満細胞腫の新たな治療薬として注目されている。このセミナーでは、分子標的薬グリベック?の作用メカニズムについて解説し、グリベック?による治療を実施した肥満細胞腫の症例について紹介する

日本獣医臨床病理学会2008年大会(2月23日・24日.さいたま市)
演題名: 一般発表1リンパ腫が疑われたイヌ70症例におけるTCRγ鎖およびIgH鎖遺伝子再構成の解析
演 者: 植松洋介 他 (有限会社ケーナインラボ 他)
概 要: (詳細はPDFファイル参照)
スライドPDF.1対応
 [はじめに] リンパ系腫瘍はイヌにおいて発生頻度の高い悪性腫瘍である。近年、イヌにおいてPCRを用いたクローナリティー解析が開発され、リンパ系腫瘍の新たな診断方法として実用化されている。この検査法はPCRによりTおよびBリンパ球のモノクローナルな増殖(腫瘍性増殖)を検出することができる。本発表では、リンパ腫が疑われたイヌ70症例においてクローナリティー解析を行い、検出率の検討を行った。さらに、70症例のうち35症例については、細胞診もしくはフローサイトメトリーによる細胞表面マーカー解析を行い、その結果とクローナリティー解析結果とを比較した。

日本獣医臨床病理学会2008年大会(2月23日・24日.さいたま市)
演題名: 一般発表2リンパ腫の遺伝子診断におけるホルマリン固定の影響)
演 者: 小池亜由美 他 (有限会社ケーナインラボ 他)
概 要: (詳細はPDFファイル参照)
スライドPDF.2が対応
 [はじめに] リンパ系腫瘍(リンパ腫、リンパ性白血病、多発性骨髄腫)は、イヌにおいて最も発生頻度の高い悪性腫瘍の一つである。そのリンパ系腫瘍の検査として、近年遺伝子検査法が注目されている。すなわち、腫瘍病変からDNAを抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりリンパ球のクローナリティー(腫瘍性増殖)を解析する方法である。DNAは比較的安定な物質のため、これまで一般的にはホルマリン固定した組織からでもクローナリティー解析が可能といわれていた。そのため解析には未固定の組織以外に、ホルマリン固定組織、ホルマリン固定パラフィン包埋組織も用いられてきた。しかし近年、長期間ホルマリン固定された組織ではPCRによる検出感度が低下することが報告された。また我々の解析でも、ホルマリン固定された組織では検出感度が低下する傾向がしばしば観察された。そこで今回、未固定組織と一定期間ホルマリン固定を行った組織でPCRの検出感度に違いが認められるか否かを検討した。

日本獣医臨床病理学会2008年大会(2月23日・24日.さいたま市)
演題名: 一般発表6非典型的な組織像を呈した猫のリンパ腫の1例
演 者: 八木原紘子 他(日本獣医生命科学大学 臨床病理学教室 他)
概 要: (詳細はPDFファイル参照)
抄録PDFが対応
 【背景】 リンパ腫は、リンパ節が腫瘍性に増殖したリンパ球に占拠され、形態的に単一の細胞集団により構成されているのが一般的である。しかhしながら、増殖している細胞が典型的な芽球タイプでない場合や、反応性に増殖したリンパ球が混在する場合、診断が非常に難しい。今回、病理組織学的検査において確定診断が困難であった猫のリンパ腫の一例について報告する。



 2007年
日本獣医臨床病理学会2007年大会(3月3日・4日.東京)
演題名: 教育講演
身近になった遺伝子診断
−リンパ腫/リンパ性白血病と肥満細胞腫−
演 者: 盆子原誠(日本獣医生命科学大学 臨床病理学教室)
概 要: (詳細はPDFファイル参照)
200703_P1200703_P2が対応
 近年、伴侶動物の飼育環境と獣医療の向上により、犬や猫の寿命は従来に比べかなり長くなっているように思われる。これに伴い悪性腫瘍を罹患する動物も確実に増えていると実感する。特にリンパ系腫瘍と肥満細胞腫は、臨床の現場において最も遭遇することが多い悪性腫瘍の一つであり、的確な診断とQOLを損なわない有効な治療が求められている。

日本獣医臨床病理学会2007年大会(3月3日・4日.東京)
演題名: 一般発表8
PCRを用いたクローナリティーの検出が有効であった犬の消化器型リンパ腫の一例
演 者: 八木原紘子 他(日本獣医生命科学大学 臨床病理学教室)
概 要: (詳細はPDFファイル参照)
200703_endai8.pdfが対応
【背景と目的】消化器型リンパ腫は犬のリンパ腫の5-7%を占め、その診断は腫瘍組織の形態的評価および免疫組織学的検査により行われている。しかしながら、消化器型リンパ腫は、臨床徴候および病理組織学的所見からではリンパ球プラズマ細胞性腸炎を含む炎症性腸炎(IBD)との鑑別が困難な場合がある。我々は、高分化型消化器型リンパ腫が疑われた症例に対し、PCRを用いたTおよびB細胞クローナリティーを検出することで、IBDとの鑑別を試みた。

日本獣医臨床病理学会2007年大会(3月3日・4日.東京)
演題名: 一般発表9
犬の慢性リンパ性白血病におけるクローナリティーの検出と免疫表現型の検討
演 者: 西村雄大 他(日本獣医生命科学大学 臨床病理学教室)
概 要: (詳細はPDFファイル参照)
200703_endai9.pdfが対応
【背景】末梢血で成熟リンパ球の著明な増加が認められた場合、慢性リンパ性白血病(CLL)と非腫瘍性のリンパ球増加症との鑑別が困難な場合がある。このような症例に対し、フローサイトメトリーを用いた免疫表現型の解析は有用であるが、増加したリンパ球が非典型的な免疫表現型を示す例では解釈が困難な場合がある。近年、T細胞レセプターおよびイムノグロブリンの再構成を利用したPCRによるクローナリティーの検出がリンパ系腫瘍の診断に応用され始めた。今回、CLLが疑われた15症例について免疫表現型の解析およびPCRを用いたクローナリティーの検出を試みた。


第4回日本獣医内科学アカデミー学術大会(2007年9月2日〜4日.東京)
演題名: 小動物臨床血液研究会・JCVIM合同シンポジウム
犬のリンパ腫診断に関する最新情報 -C-1 
「リンパ腫における遺伝子診断の活用」
演 者: 八木原紘子 他(日本獣医生命科学大学 臨床病理学教室)
概 要: (詳細はPDFファイル参照)
200708_academyP1.pdf200708_academyP2.pdfが対応
【はじめに】
 リンパ腫は悪性腫瘍の中でも抗癌剤により優れた治療効果が期待できる数少ない腫瘍である。そのため適切な診断を行い、早期に治療を開始することが動物の長期生存を狙う上で重要となる。リンパ腫の診断には細胞診または病理組織検査による形態診断およびフローサイトメトリーによる表面抗原の検索が有用であり、多くはこれらにより確定診断が可能である。しかしながら、腫瘍発症初期や高分化型リンパ腫、あるいは腫瘍に随伴し反応性リンパ球の出現を伴う場合は診断が曖昧となり、治療を開始する十分な根拠が得られないことも多々経験する。そこで、より客観的な評価として遺伝子診断が重要と考えられる。実際、人のリンパ系腫瘍では遺伝子診断はルーチンに行われている。近年、犬においてもPCR法を用いたリンパ腫の遺伝子診断法を確立し、商業ベースでの検査が可能となった。本シンポジウムでは、リンパ腫の遺伝子診断について、原理から実際の活用までを解説する。


アメリカ獣医内科学会(2007年 6月6日〜9日.ワシントン州 ・シアトル)
The 2007 ACVIM (American College of Veterinary Internal Medicine) Forum in Seattle, Washington
演題名: PCR法によるイヌの慢性リンパ性白血病(CLL)におけるクロナリティーの検出
DETECTION OF CLONALITY IN CANINE CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA BY POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY.
演 者: 八木原紘子 他(日本獣医生命科学大学 臨床病理学教室)
H Yagihara1, K Tamura1, Y Saito1, R Sato1, Y Nishimura1, M Isotani1, Y Uematsu2, T Yamaguchi2, M Bonkobara1, T Washizu1.
1. Nippon Veterinary and Life Science University, Tokyo, Japan.
2. Canine Lab. Inc., Tokyo, Japan
概 要:  慢性リンパ性白血病(CLL)と非腫瘍性リンパ球増加症を区別することは難しい場合がある。その場合、リンパ球のフェノタイプ解析は有用であるが、最終的な診断は出来ない。最近我々は、イヌゲノムデータベースに基づいて、T細胞受容体γ鎖(TCRγ)遺伝子と免疫グロブリンH鎖(IgH)遺伝子を標的としてT細胞またはB細胞における単クローン性(モノクローナリティー)検出のためのPCR法を開発した。本研究では、CLLが疑われるイヌ由来のリンパ球を用いて、フェノタイプ解析とPCR法によるクロナリティー解析を行った。
 フローサイトメトリー法による細胞表面のCD3、CD4、CD8、CD21、およびIgG(s-IgG)の解析は、リンパ球数が8,000から>100,000セル/μlの15頭のイヌの末梢血単核細胞(PBMC)を用いて実施した。PCR法によるクロナリティー解析は、リンパ球から抽出したゲノムDNAについて、4セットのTCRγ鎖検出用プライマーと1セットのIgH鎖検出用プライマーを用いて実施した。
 その結果、モノクローナルな増幅は15症例の全てで検出され、内13症例でTCRγ鎖遺伝子他の2症例ではIgH鎖遺伝子のモノクローナリティーが確認された。TCRγ鎖遺伝子のモノクローナリティーを示す13症例の免疫表現型は、1症例でCD3+/CD4+/CD8−と6症例でCD3+/CD4−/CD8+であったが、他の6症例にはT細胞抗原に特徴的なパターンは観察されなかった。IgH鎖のモノクローナリティーを示す2症例について、1症例ではB細胞抗原(CD3−/CD21+/s-IgG+)の典型的なパターンが観察されたが、他の1症例では観察されなかった。
CLLと非腫瘍性リンパ球増加症を区別するための方法として、PCR法によるリンパ球のクロナリティー検出は有用であること、また特にリンパ球の免疫表現型が不明瞭な場合に有効であること、が示唆された。

 Sometimes, it is difficult to distinguish chronic lymphocytic leukemia (CLL) from non-neoplastic lymphocytosis. Immunophenotyping of lymphocytes is helpful, however, it does not always provide the definitive diagnosis. Based on canine genome database, we recently developed PCR assays for detection of monoclonality in T- and B-cells by targeting T-cell receptor gamma chain (TCRg) gene and immunoglobulin heavy chain (IgH) gene, respectively. In the present study, lymphocytes obtained from dogs suspected CLL were immunophenotyped and analyzed to detect the clonality using the PCR assays.
 Flow cytometric analyses for cell surface antigens including CD3, CD4, CD8, CD21, and IgG were performed on peripheral blood mononuclear cells in 15 dogs with lymphocytosis from 8,000 to >100,000 cells/ml. Genomic DNA was extracted from the lymphocytes and PCR-based clonality analysis was performed using 4 sets of TCRg primers and a single set of IgH primers.
 Monoclonal amplification was detected in all of 15cases. In 13 cases, monoclonality was seen in TCRg gene and in other 2 cases, it was seen in IgH gene. Immunophenotype of 13 cases with monoclonal amplifications of TCRg gene include CD3+/CD4+/CD8- (1 case) and CD3+/CD4-/CD8+ (6 cases). In other 6 cases, definitive patterns of T-cell antigens were not observed. Regarding 2 cases with monoclonal amplifications of IgH, typical pattern of B-cell antigens (CD3-/CD21+/IgG+) was seen in one case while not in another case.
 In conclusion, it is suggested that PCR-based assays for detection of clonality of lymphocytes are useful to distinguish CLL from non-neoplastic lymphocytosis, especially the immunophenotype is obscure.


第144回日本獣医学会学術集会(2007年9月2日〜4日.札幌、酪農学園大学)
演題名: I-39 イヌNeural-cell adhesion molecule (N-CAM)/CD56に対する新規モノクローナル抗体
演 者: 小池亜由美1,3、植松洋介1,3、盆子原誠2、山口智宏1,3、鷲巣月美2、新井敏郎1
(1日本獣医生命科学大学 獣医生理化学教室、2日本獣医生命科学大学 獣医臨床病理学教室、3(有)ケーナインラボ 検査培養研究室)
概 要: [背景] Neural-cell adhesion molecule (N-CAM)/CD56は、神経細胞の移動・分化・分裂・神経突起の伸張などさまざまな神経細胞の機能発現において重要な役割を果たしている。また、Natural killer細胞の細胞表面に発現し、MHC非依存性の細胞障害活性において標的細胞への接着に関与する。今回我々は、イヌのN-CAM/CD56に対する抗体(K9BYU)を作製したので、その特徴について報告する。 [材料と方法]イヌCD56の塩基配列をもとに遺伝子組み換えを行い、大腸菌に発現させた組み換えタンパクを免疫抗原として用いた。アフィニティー精製した組み換えタンパクをマウスに接種し、定法に従ってモノクローナル抗体を得た。Sf9 (Spondoptera fugiperda)にイヌおよびネコのCD56を発現させ、ウエスタンブロット、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー(FCM)を用いて本抗体の反応性を検討した。 [結果および考察] 本抗体は、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光染色において、特異的にイヌCD56を認識した。一方、FCM解析においては、反応は弱いものの若干のピーク値の上昇を認めた。このことから、本抗体は抗原の立体構造の違い関らずCD56抗原を特異的に認識することが示唆された。本研究は「文部科学省学術フロンティア推進事業」による私学助成を得て行われた。



  雑誌掲載
★SA Medicine 52号(2007年12月号)の掲載記事の中で、当社が紹介されました
SA Medicine (Journal of Small Animal Medicine ) 52 Vol.9 No.6 2007 p.5-13(pp.34-40)
特集:生検・細胞診の手技−後編−
「リンパ節および脾臓の生検・細胞診の手技」
呰上 大吾 (日本獣医生命科学大学獣医学部獣医保健看護学科臨床部門)

はじめに
臨床検査は、我々がさまざまな疾患を診断する上で最初に行う医療行為であり、その結果によって治療の流れが決定される。なかでも生検は得られる情報の多さと精度の高さにおいてきわめて有用性の高い臨床検査であり、とくに腫瘍性疾患の診断・ステージングには必要不可欠の検査と言えるだろう。
生検によって得られる情報量は、生検サンプル内に含まれる病変組織の容積に大きく依存する。そのため最も多くの情報を得られる生検法は切除生検であり、部分生検、針コア生検、針吸引生検の順に診断精度は下がる。しかしながら腫瘍症例はしばしば病期の進行した段階で来院するため、外科的切除不能の場合や、麻酔もかけられないような状態であることが少なくない。また、症例に与える苦痛、実施の難易度や経済性を考えると、診断精度はやや落ちるものの無麻酔で実施できる針コア生検や針吸引生検を適用する場面は多い。

――――――――――(中略)――――――――――

本稿ではリンパ節や脾臓などのリンパ系組織の生検・細胞診を行う上でのポイントと得られたサンプルの処理法について解説を行う。

 



★J-VET 2007年6月号の掲載記事の中で当社が紹介されました。
小動物診療のエビデンス、 腫瘍のエビデンス4(P.5〜13)
「犬のリンパ腫の診断:クローナリティー解析」
盆子原 誠 (日本獣医生命科学大学獣医臨床病理学教室)

ポイント
B細胞が産生するイムノグロブリン、あるいはT細胞の表面に存在するT細胞レセプターには遺伝子学的な多様性があり、これを利用することでリンパ球のクローナリティーを評価することが出来る。
近年、犬のクローナリティー解析を受託するベンチャー企業が現れ、誰でも容易に利用できるようになった。
PCRによるクローナリティー解析は、きわめて少量の生体サンプル(針吸引サンプルや胸水、腹水などの貯留液)で行える。
従来の形態学的診断に加えてクローナリティー解析を行うことで、より客観性の高い診断のエビデンスを提示することができる。

 


★SURGEON65号(2007年9月号)の掲載記事の中で、当社が紹介されました。

SURGEON65 2007Sep.-Oct.(Tech. Mag. Vet. Surg. Vol.11 No.5 pp.34-40)

特集 I:イヌの皮膚肥満細胞種
「肥満細胞種に対する分子標的療法」
盆子原 誠 (日本獣医生命科学大学獣医臨床病理学教室)

はじめに
近年のゲノム・プロテオーム研究の著しい発展を背に、ヒトの癌治療では次世代の治療薬として分子標的薬が脚光を浴びている。グリベックR(メシル酸イマチニブ)を皮切りに続々と新たな分子標的薬が登場し、癌治療の可能性が大きく前進した。分子標的薬は癌の発生・増殖における特定の分子機構を標的とするため、きわめて理論的で非常に効果が高い。今後10年で分子標的薬が標準的な治療法に組み込まれ、癌治療薬の中心的地位を確立していくとの予測もある。一方、動物の癌治療では分子標的薬の適応についてはほとんどわかっておらず、どれだけの利益を獣医臨床にもたらすかは不明である。現在、効果が知られている分子標的薬は、肥満細胞種に対して用いられるグリベックRのみと言っても良い。しかしながら、すべての肥満細胞種で同様の効果が認められるわけではなく、むしろ一部の症例のみが適応と考えられる。本稿では、グリベックRについて解説し、今後の可能性について考察する。
 









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